Petunjuk Praktis Kegiatan Laboratorium Kultur Jaringan

A. STERILISASI RUANG TANAM & RUANG KULTUR

·      Sterilisasi awal ruang tanam & ruang kultur yaitu dengan cara disemprot dengan formalin teknis 40 % pada dinding dan lantai, lalu ruangan ditutup selama 1 minggu. Sisa formalin di pel dengan alkohol dan udara diruangan dikeluarkan dengan Egoster.

·       Perawatan Lab. harus di pel pakai obat pel setiap hari atau dengan alkohol.

·       Penyaring debu LAF 3 bulan sekali harus dicuci serta sebelum dan sesudah dipakai ruangan LAF di lap pakai alkohol.

·       Sebelum LAF dipakai, lampu Ultra Violet dinyalakan + 30 menit dan ditutup dengan kain hitam, jangan segera masuk ruang tanam setelah lampu UV dimatikan, karena timbulnya gas ozon (0₃) yang bersifat racun.

·       Petugas yang masuk keruang ini harus berpakaian bersih, pakai Jas Lab. dan tangan harus dibasuh alkohol 70 - 95 %.

B. STERILISASI GELAS (TABUNG KULTUR) & ALAT-ALAT

·      Gelas dicuci pakai air, lalau direndam dilarutan bayclean 20 % selama 24 jam, kemudian dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air bersih lalu ditiriskan hingga kering. Setelah kering disterilkan dalam oven selama 24 jam pada suhu 80 ⁰C atau 6 jam pada suhu 100 ⁰C atau 4 jam pada suhu 160 ⁰C.

·      Pinset, pisau scalpel dan jarum ose sebelum digunakan, dicelupkan dalam alkohol 96 % dan dibakar menjelang digunakan.

C. PEMBUATAN MEDIA, STERILISASI & INKUBASI

Petunjuk pembuatan larutan stok media (untuk 10 liter) :

1. Stok A. (NH₄ N O₃)       16.5 gr larutkan dalam aquadest menjadi 500 ml

2. Stok B. (KNO₃)             19.0 gr larutan dalam aquadest menjadi 500 ml

3. Stok C. (CaCl₂ 2H₂O)    4.4 gr larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml

4. Stok D. H₃ BO₃                                  0.062 gr

KH₂ PO4                       1.7 gr

C₀ CL₂                                    0.00026 gr

Na₂ M₀ O4 2H₂O           0.0025 gr

KI                                  0.0083 gr

Bahan ini larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml

5. Stok E. M₉ SO4 7H₂O               3.7 gr

Zn SO4 7H₂O                0.086 gr

Cu SO4 5H₂O                0.00026 gr

Mn SO4 7H₂O               0.1505 gr

Bahan ini larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml

6. Stok F. Na2 EDTA        0.372 gr larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml

Fe SO4 H2O      0.278 gr larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml, aduk terus sampai homogen (tidak terjadi endapan kering)

7. Stok G. Di timbang langsung

Vitamin	I liter	6 liter	10 liter
Inositol Thiamine Pyridoxine Biotine	1.0 mgr 0.4 mgr 4.0 mgr 0.2 mgr	6 mgr 2.4 mgr 24 mgr 1.2 mgr	10 mgr 4 mgr 40 mgr 2 mgr

Hormon	I liter	6 liter	10 liter	Keterangan
2.4 D I AA Dalapan NAA KINETIN	3 mgr 2 mgr 59 mgr 2 mgr 0.1 mgr	18 mgr 12 mgr 354 mgr 12 mgr 0.6 mgr	30 mgr 20 mgr 590 mgr 20 mgr 1 mgr	MS I MS II MS II MSR MSR

Untuk stok G larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml

8. Untuk 1 liter media ditambah

            - Sucrose 30 gr

            - Agar-agar 8 gr

            - Air kelapa muda 100 ml

            - pH 5.8

9. - H₁ (NAA) Larutkan dengan 0.1 N HCI atau 0.1 N NaOH setelah larut tambahkan aquadest sampai dengan 50 ml

- H₂ (Dalapon) larutkan dalam aquadest sampai 50 ml

    - I (2.4 D) Larutkan dengan 0.1 N HCL atau 0.1 N Na₀H setelah larut tambahkan aquadest sampai dengan 50 ml

*      CARA PEMBUATAN I LITER LARUTAN MS I, MST atau MSR

1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml

2. Timbang sukrosa 30 gr untuk MS I, MS.T dan untuk MSR 45 gr masukan dalam erlenmeyer larutkan dengan aquadest sampai 400 ml

3. Siapkan beaker glass 1000 ml

4. Ambil stok          A. 50 ml

                                    B. 50 ml

                                    C. 10 ml

                                    D. 10 ml

                                    E. 10 ml

                                    F. 10 ml

                                    G. 10 ml

Masukan dalam beaker glass sambil terus diaduk dengan Stirer/pengaduk

5. Tambahkan aquadest 200 ml

6. Tambahkan air kelapa 100 ml

7. Campurkan larutan sukrosa tadi sambil terus diaduk

8. Untuk membuat media MS I tambahkan larutan 2. 4D (I) 5 ml dan untuk membuat media MS. T dan MSR tambahkan larutan NAA (H₁) 5 ml dan Dalapon (H₂) 5 ml

9. Tambahkan aquadest sampai volume 950 ml

10. Kalibrasi pH meter dengan buffer pH 7.0 dan pH 4.0

11. Campurkan larutan (7) diatur pH nya hingga 5.8, jika pH terlalu rendah tambahkan 0.1 N NaOH sedikit demikit hingga 5.8. Jika pH terlalu tinggi tambahkan 0.1 N HCL sedikit demi sedikit sampai pH 5.8

12. Timbang agar-agar 8 gr untuk MS I dan MS.T masukan dalam erlenmeyer 1000 ml. Untuk media MSR tanpa agar

13. Larutan dengan pH 5.8 masukan dalam erlenmeyer yang sudah ada agarnya dan tambahkan aquadest sampai tanda 1000 ml, tutup mulut tabung dengan alumunium foil

14. Larutan dipanaskan (untuk melarutkan agar-agar) sampai temperatur 100 ⁰C selama 15 menit sambil diaduk

15. Larutan panas dipanaskan dengan terus diaduk supaya agar tercampur dengan baik, dibagi-bagi dan dimasukan kedalam tabung kultur steril

16. Tabung yang telah diisi media ditutup dan siap disterilkan dengan autoclave temperature 121 ⁰C dan tekanan 1 atm selama 20 menit

17. Media yang sudah di autoclave, lalu diinkubasi selama 3 hari

18. Media yang steril dan tidak terkontaminasi saja yang siap untuk ditanami

D. PERSIAPAN BAHAN TANAM (EKSPLANT)

·      Bahan tanam diambil dari kebun bibit yang sehat dan umur tanaman berkisar 3 - 6 bulan

·      Pucuk tebu yang mengandung titik tumbuh dipotong dan dibersihkan daunnya

·      Bersihkan laminair air flow dengan alkohol 95 %, hidupkan lampu Ultra Violet selama 30 menit

·      Matikan lampu Ultra Violet, dan nyalakan laminair air flow

·      Dengan menggunakan pinset, potongan pucuk yang mengadung titik tumbuh disterilkan dengan pembakaran yaitu dengan mencelupkan potongan pucuk tersebut kedalam alkohol 95 %, kemudian dilewatkan diatas lampu spiritus dan biarkan alkoholnya habis terbakar, kupas pelepah daun yang menutupi potongan pucuk tadi, ulangi 2 - 3 kali pembakaran

·      Pengelupasan pelepah diakhiri sampai nampak daun muda yang masih tergulung dengan diameter + 1 cm

·      Potongan tersebut dibuat irisan-irisan melintang dengan pisau scalpel dimulai dari 2 cm diatas titik tumbuh dengan tebal 2 - 3 mm pada daun yang masih tergulung sebanyak 8 - 10 irisan. Irisan-irisan daun muda (eksplant) ini siap untuk ditanam

E. PENANAMAN EKSPLANT

Tujuannya : Menumbuhkan kalus dari penanaman jaringan irisan daun muda yang masih menggulung

·      Menyiapkan tabung kultur yang berisi media MS I, potongan-potongan jaringan daun muda yang akan dikulturkan dan alat-alat seperti lampu spiritus, scalpel, pinset, ose, kapas, alkohol, labu semprot dll.

·      Dengan menggunakan jarum ose yang steril,,irisan-irisan jaringan daun muda dimasukan kedalam tabung yang berisi media MS I sebanyak 4 eksplant untuk satu tabung, lalu ditutup rapat.

·      Beri label varietas dan tanggal penanaman pada tabung tersebut, dan letakan tabung-tabung tersebut diatas rak inkubasi

·      Bersihkan laminair air flow dengan alkohol 95 % dan kembalikan alat-alat yang sudah dibersihkan pada tempat semula

·      Amati kultur jaringan daun tersebut. Dalam waktu 14 hari pada bagian permukaan irisan akan nampak pertumbuhan kalus

·      Pertumbuhan kalus makin membesar dengan warna keputihan sampai kekuningan

·      Setelah berumur 6 - 7 minggu kalus siap dipindahkan ke media MS I yang baru

F. SUB CULTURE CALLUS

Tujuannya : Menumbuhkan kalus dari irisan-irisan kalus

·      Menyiapkan tabung yang berisi media MS I dan tabung yang berisi kalus yang akan di sub kultur kalus dan alat-alat seperti pinset, scalpel, ose, telenan, botol semprot, alkohol, alumunium foil, lampu spiritus dll.  

·      Mensterilkan laminair air flow

·      Bakar alumunium foil diatas lampu spiritus, kemudian letakan diatas telenan

·      Ambil tabung kultur yang berisi kalus, bakar mulut tabung diatas lampu spiritus dan keluarkan kalus dari tabung dengan menggunakan jarum ose dan letakan diatas kertas alumunium foil dialasi telenan tadi

·      Pilih kalus yang baik, dengan menggunakan pisau scalpel kalus dipotong-potong dengan ukuran + 2 mm²

·      Potongan kalus dimasukan kedalam tabung yang berisi media MS I dengan menggunakan jarum ose, 1 tabung berisi 10 buah kalus

·      Tuliskan varietas, tanggal penanaman kalus dan tanggal pemindahan kalus pada tabung kultur tersebut dan letakan tabung-tabung tersebut diatas rak inkubasi

·      Bersihkan LAF dengan alkohol 95 % dan kembalikan alat-alat yang sudah dibersihkan pada tempatnya

·      Amati perkembangan kalus tersebut dalam waktu + 1 minggu pertumbuhan kalus mulai berkembang dan setelah berumur 4 - 6 minggu kalus siap di deferensiasi ke media MS II.

G. DIFFERENSIASI KE MEDIA MS II

Tujuannya : Menumbuhkan planlet dari irisan kalus

·      Menyiapkan tabung yang berisi media MS II dan tabung yang berisi kalus siap dideferensiasi dan alat-alat seperti pinset scalpel, jarum ose, telenan, lampu spiritus serta bahan-bahan seperti kapas, alumunium foil, alkohol 95 % dll.

·      Mensterilkan laminair air flow

·      Bakar alumunium foil diatas lampu spiritus, kemudian letakan diatas telenan

·      Ambil tabung kultur yang berisi kalus, bakar mulut tabung diatas lampu spiritus, dan kelurkan kalus dari tabung dengan menggunakan jarum ose dan letakan diatas kertas alumunium foil yang dialasi telenan tadi

·      Pilih kalus yang baik dan dengan menggunakan pisau scalpel kalus dipotong-potong dengan ukuran + 2 mm²

·      Potongan kalus dimasukan kedalam tabung kultur berisi media MS II dengan menggunakan jarum ose. 1 tabung kultur berisi 3 buah kalus

·      Tuliskan varietas, tanggal penanaman kalus dan tanggal pemindahan kalus pada media MS II pada tabung kultur tersebut, dan letakan tabung-tabung tersebut diatas rak inkubasi

·      Amati perkembangan kalus tersebut. Dalam waktu + 1 minggu disamping pertumbuhan kalus berkembang, juga dapat dilihat bintik-bintik kecil berwarna hijau yang pada perkembangan selanjutnya akan tumbuh menjadi akar bintik-bintik merah pada kalus akan tumbuh menjadi akar

·      Setelah + 6 minggu planlet tersebut dapat di ploriferasi ke media MSR 

H. PLORIFERASI DAN SPLIT PLORIFERASI

Tujuannya : Memperbanyak pertumbuhan tunas secara cepat

·      Menyiapkan tabung yang berisi media MSR dan tabung yang berisi tunas-tunas tebu yang siap di ploriferasi

·      Menyiapkan alat-alat seperti gunting, scalpel, pinset, jarum ose, telenan, lampu spiritus, labu semprot dan bahan-bahan seperti kapas, alkohol, alumunium foil, dsb.

·      Mensterilisasi laminair air flow

·      Bakar alumunium foil ditas lampu spiritus kemudian letakkan diatas telenan

·      Ambil tabung kultur yang berisi tunas-tunas tebu, keluarkan tunas-tunas tersebut dari tabung dan cuci bersih dengan air mengalir dan bilas dengan aquadest

·      Tunas-tunas yang masih bergerombol tersebut akar dan daunnya dipotong, lalu dimasukan ke tabung kultur yang berisi media MSR. 1 tabung berisi 3 gerombol

·      Setelah 4 - 6 minggu bisa di Split ploriferasi di media MSR baru dengan prosedur yang sama

I. ROOTING

Tujuannya : Menumbuhkan akar pada media MSR

·      Prosedur kerjannya sama seperti ploriferasi dan split ploriferasi

·      Setelah 4 - 6 minggu siap untuk dipindahkan ke nampan yang berisi tanah steril

J.  PRA AKLIMATISASI DAN AKLIMATISASI

Tujuannya : Pemindahan planlet dari tabung kultur ke media tanah steril dalam nampan dan ke polybag

·      Menyiapkan alat-alat yang dibutuhkan seperti gunting, nampan plastik, polybag, cangkul, drum dll.

·      Menyiapkan campuran tanah steril dengan perbandingan tanah 1 : pupuk kandang 1 : pasir 1, dengan cara : 1/3 bagian drum diisi campuran tanah, pupuk kandang dan pasir, lalu diberi formalin 40 % sebanyak 600 cc. Lalu dilapisi campuran tanah lagi 1/3 bagian drum dan diberi formalin 40 % sebanyak 600 cc. Lalu sisanya dilapisi campuran tanah lagi dan diberi formalin 400 cc. Permukaan atas dilapisi tanah tipis, lalu drum ditutup dengan plastik dan diinokubasi selama 48 jam. setelah 48 jam tanah dikeluarkan dari drum dan dikeringanginkan, tiap hari dibalik, sampai bau formalin hilang. Setelah itu tanah diayak dan dimasukan ke nampan plastik

·      Planlet yang akan diaklimatisasi dikeluarkan dari tabung dicuci dan dibersihkan dari sisa-sisa media

·      Potong ujung daunnya dan dipisahkan satu persatu dengan hati-hati, usahakan setiap planlet mempunyai akar yang sempurna. Planlet yang terlalu kecil dipisahkan dalam bentuk kelompok

·      Setiap planlet (tunggal atau kelompok) ditanam dalam nampan yang telah berisi tanah steril

·      Nampan-nampan tersebut diletakan diudara terbuka namun masih dinaungi selama 5 hari, selanjutnya tanaman tersebut dibawa ke lapang, pada umur 10 hari tanaman dipupuk dengan ZA sebanyak + 0.05 gr/polybag (+ 1.5 gr/nampan) setiap pagi & sore tanaman disiram

·      Setelah 3-4 minggu tanaman dalam nampan displit tunggal ke polybag. Akar tanaman dipotong, disisakan 2-3 cm, daun dipotong untuk mengurangi penguapan lalu tanaman tersebut ditanam pada polybag yang berisi media tanah yang tidak steril

·      Tiap pagi dan sore tanaman disiram, pada umur + 1 minggu tanaman dipupuk ZA 0.6 gr/polybag

·      Setelah berumur 6 minggu tanaman dipindah ke kebun.


Selesai.....