Petunjuk Praktis Kegiatan Laboratorium Kultur Jaringan
A. STERILISASI RUANG TANAM
& RUANG KULTUR
· Sterilisasi
awal ruang tanam & ruang kultur yaitu dengan cara disemprot dengan formalin
teknis 40 % pada dinding dan lantai, lalu ruangan ditutup selama 1 minggu. Sisa
formalin di pel dengan alkohol dan udara diruangan dikeluarkan dengan Egoster.
·
Perawatan Lab. harus di pel pakai obat pel
setiap hari atau dengan alkohol.
·
Penyaring debu LAF 3 bulan sekali harus
dicuci serta sebelum dan sesudah dipakai ruangan LAF di lap pakai alkohol.
·
Sebelum LAF dipakai, lampu Ultra Violet
dinyalakan + 30 menit dan ditutup dengan kain hitam, jangan segera masuk
ruang tanam setelah lampu UV dimatikan, karena timbulnya gas ozon (03)
yang bersifat racun.
·
Petugas yang masuk keruang ini harus
berpakaian bersih, pakai Jas Lab. dan tangan harus dibasuh alkohol 70 - 95 %.
B. STERILISASI GELAS (TABUNG KULTUR) & ALAT-ALAT
·
Gelas
dicuci pakai air, lalau direndam dilarutan bayclean 20 % selama 24 jam,
kemudian dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air bersih lalu ditiriskan
hingga kering. Setelah kering disterilkan dalam oven selama 24
jam pada suhu 80 0C atau 6 jam pada suhu 100 0C atau 4
jam pada suhu 160 0C.
·
Pinset,
pisau scalpel dan jarum ose sebelum digunakan, dicelupkan dalam alkohol 96 %
dan dibakar menjelang digunakan.
C. PEMBUATAN MEDIA, STERILISASI & INKUBASI
Petunjuk pembuatan larutan stok media (untuk 10 liter) :
1. Stok A. (NH4 N O3) 16.5 gr larutkan dalam aquadest menjadi 500 ml
2. Stok B. (KNO3) 19.0
gr larutan dalam aquadest menjadi 500 ml
3. Stok C. (CaCl2 2H2O) 4.4 gr larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml
4. Stok D. H3 BO3 0.062
gr
KH2 PO4 1.7
gr
C0 CL2 0.00026
gr
Na2 M0 O4 2H2O 0.0025 gr
KI 0.0083
gr
Bahan ini larutkan dalam
aquadest menjadi 100 ml
5. Stok E. M9 SO4 7H2O 3.7 gr
Zn SO4 7H2O 0.086
gr
Cu SO4 5H2O 0.00026
gr
Mn SO4 7H2O 0.1505
gr
Bahan ini larutkan dalam
aquadest menjadi 100 ml
6. Stok F. Na2 EDTA 0.372 gr
larutkan dalam aquadest menjadi 100 ml
Fe SO4 H2O 0.278 gr larutkan
dalam aquadest menjadi 100 ml, aduk terus sampai homogen (tidak terjadi endapan
kering)
7. Stok G. Di timbang langsung
Vitamin
|
I liter
|
6 liter
|
10 liter
|
Inositol
Thiamine
Pyridoxine
Biotine
|
1.0 mgr
0.4 mgr
4.0 mgr
0.2 mgr
|
6 mgr
2.4 mgr
24 mgr
1.2 mgr
|
10 mgr
4 mgr
40 mgr
2 mgr
|
Hormon
|
I liter
|
6 liter
|
10 liter
|
Keterangan
|
2.4
D
I
AA
Dalapan
NAA
KINETIN
|
3 mgr
2 mgr
59
mgr
2 mgr
0.1
mgr
|
18
mgr
12
mgr
354
mgr
12
mgr
0.6
mgr
|
30
mgr
20
mgr
590
mgr
20
mgr
1 mgr
|
MS I
MS II
MS II
MSR
MSR
|
Untuk stok G larutkan dalam
aquadest menjadi 100 ml
8.
Untuk 1 liter media ditambah
- Sucrose 30 gr
- Agar-agar 8 gr
- Air kelapa muda 100 ml
- pH 5.8
9. - H1 (NAA) Larutkan dengan 0.1 N HCI
atau 0.1 N NaOH setelah larut tambahkan aquadest sampai dengan 50 ml
- H2 (Dalapon) larutkan dalam aquadest
sampai 50 ml
- I (2.4 D)
Larutkan dengan 0.1 N HCL atau 0.1 N Na0H setelah larut tambahkan
aquadest sampai dengan 50 ml
*
CARA PEMBUATAN I LITER LARUTAN MS I, MST atau MSR
1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml
2. Timbang sukrosa 30 gr untuk MS I, MS.T dan untuk
MSR 45 gr masukan dalam erlenmeyer larutkan dengan aquadest sampai 400 ml
3. Siapkan beaker glass 1000
ml
4. Ambil stok A. 50 ml
B.
50 ml
C.
10 ml
D.
10 ml
E.
10 ml
F.
10 ml
G.
10 ml
Masukan dalam beaker glass
sambil terus diaduk dengan Stirer/pengaduk
5. Tambahkan aquadest 200 ml
6. Tambahkan air kelapa 100
ml
7. Campurkan larutan sukrosa tadi sambil terus diaduk
8. Untuk
membuat media MS I tambahkan larutan 2. 4D (I) 5 ml dan untuk membuat media MS.
T dan MSR tambahkan larutan NAA (H1) 5 ml dan
Dalapon (H2) 5 ml
9. Tambahkan aquadest sampai
volume 950 ml
10. Kalibrasi pH meter
dengan buffer pH 7.0 dan pH 4.0
11.
Campurkan larutan (7) diatur pH nya hingga 5.8, jika pH terlalu rendah
tambahkan 0.1 N NaOH sedikit demikit hingga
5.8. Jika pH terlalu tinggi tambahkan 0.1 N HCL
sedikit demi sedikit sampai pH 5.8
12. Timbang
agar-agar 8 gr untuk MS I dan MS.T masukan dalam erlenmeyer 1000 ml. Untuk
media MSR tanpa agar
13. Larutan
dengan pH 5.8 masukan dalam erlenmeyer yang sudah ada agarnya dan tambahkan
aquadest sampai tanda 1000 ml, tutup mulut tabung dengan alumunium foil
14. Larutan dipanaskan (untuk melarutkan agar-agar)
sampai temperatur 100 0C selama 15 menit sambil diaduk
15. Larutan panas dipanaskan dengan terus diaduk supaya
agar tercampur dengan baik, dibagi-bagi dan dimasukan kedalam tabung kultur
steril
16. Tabung yang telah diisi media ditutup dan siap
disterilkan dengan autoclave temperature 121 0C dan tekanan 1 atm
selama 20 menit
17. Media yang sudah di autoclave, lalu diinkubasi selama 3 hari
18. Media yang steril dan tidak terkontaminasi saja yang siap untuk
ditanami
D. PERSIAPAN
BAHAN TANAM (EKSPLANT)
·
Bahan
tanam diambil dari kebun bibit yang sehat dan umur tanaman berkisar 3 - 6 bulan
·
Pucuk
tebu yang mengandung titik tumbuh dipotong dan dibersihkan daunnya
·
Bersihkan laminair air flow dengan alkohol 95
%, hidupkan lampu Ultra Violet selama 30 menit
·
Matikan lampu Ultra Violet, dan nyalakan
laminair air flow
·
Dengan menggunakan pinset, potongan pucuk
yang mengadung titik tumbuh disterilkan dengan pembakaran yaitu dengan
mencelupkan potongan pucuk tersebut kedalam alkohol 95 %, kemudian dilewatkan
diatas lampu spiritus dan biarkan alkoholnya habis terbakar, kupas pelepah daun
yang menutupi potongan pucuk tadi, ulangi 2 - 3 kali pembakaran
·
Pengelupasan pelepah diakhiri sampai nampak
daun muda yang masih tergulung dengan diameter + 1 cm
· Potongan
tersebut dibuat irisan-irisan melintang dengan pisau scalpel dimulai dari 2 cm
diatas titik tumbuh dengan tebal 2 - 3 mm pada daun yang masih tergulung
sebanyak 8 - 10 irisan. Irisan-irisan daun muda (eksplant) ini siap untuk
ditanam
E. PENANAMAN
EKSPLANT
Tujuannya :
Menumbuhkan kalus dari penanaman jaringan irisan daun muda yang masih
menggulung
· Menyiapkan
tabung kultur yang berisi media MS I, potongan-potongan jaringan daun muda yang
akan dikulturkan dan alat-alat seperti lampu spiritus, scalpel, pinset, ose,
kapas, alkohol, labu semprot dll.
· Dengan
menggunakan jarum ose yang steril,,irisan-irisan jaringan daun muda dimasukan
kedalam tabung yang berisi media MS I sebanyak 4 eksplant untuk satu tabung,
lalu ditutup rapat.
· Beri
label varietas dan tanggal penanaman pada tabung tersebut, dan letakan
tabung-tabung tersebut diatas rak inkubasi
· Bersihkan
laminair air flow dengan alkohol 95 % dan kembalikan alat-alat yang sudah
dibersihkan pada tempat semula
·
Amati
kultur jaringan daun tersebut. Dalam waktu 14 hari pada bagian permukaan irisan
akan nampak pertumbuhan kalus
· Pertumbuhan
kalus makin membesar dengan warna keputihan sampai kekuningan
·
Setelah
berumur 6 - 7 minggu kalus siap dipindahkan ke media MS I yang baru
F. SUB CULTURE CALLUS
Tujuannya : Menumbuhkan
kalus dari irisan-irisan kalus
·
Menyiapkan
tabung yang berisi media MS I dan tabung yang berisi kalus yang akan di sub kultur
kalus dan alat-alat seperti pinset, scalpel, ose, telenan, botol semprot,
alkohol, alumunium foil, lampu spiritus dll.
· Mensterilkan
laminair air flow
·
Bakar
alumunium foil diatas lampu spiritus, kemudian letakan diatas telenan
·
Ambil
tabung kultur yang berisi kalus, bakar mulut tabung diatas lampu spiritus dan
keluarkan kalus dari tabung dengan menggunakan jarum ose dan letakan diatas
kertas alumunium foil dialasi telenan tadi
·
Pilih
kalus yang baik, dengan menggunakan pisau scalpel kalus dipotong-potong dengan
ukuran + 2 mm2
·
Potongan
kalus dimasukan kedalam tabung yang berisi media MS I dengan menggunakan jarum
ose, 1 tabung berisi 10 buah kalus
·
Tuliskan
varietas, tanggal penanaman kalus dan tanggal pemindahan kalus pada tabung
kultur tersebut dan letakan tabung-tabung tersebut diatas rak inkubasi
·
Bersihkan
LAF dengan alkohol 95 % dan kembalikan alat-alat yang sudah dibersihkan pada
tempatnya
·
Amati
perkembangan kalus tersebut dalam waktu + 1 minggu pertumbuhan kalus mulai
berkembang dan setelah berumur 4 - 6 minggu kalus siap di deferensiasi ke media
MS II.
G. DIFFERENSIASI KE MEDIA MS II
Tujuannya : Menumbuhkan
planlet dari irisan kalus
·
Menyiapkan
tabung yang berisi media MS II dan tabung yang berisi kalus siap dideferensiasi
dan alat-alat seperti pinset scalpel, jarum ose, telenan, lampu spiritus serta
bahan-bahan seperti kapas, alumunium foil, alkohol 95 % dll.
· Mensterilkan
laminair air flow
·
Bakar
alumunium foil diatas lampu spiritus, kemudian letakan diatas telenan
·
Ambil
tabung kultur yang berisi kalus, bakar mulut tabung diatas lampu spiritus, dan
kelurkan kalus dari tabung dengan menggunakan jarum ose dan letakan diatas
kertas alumunium foil yang dialasi telenan tadi
·
Pilih
kalus yang baik dan dengan menggunakan pisau scalpel kalus dipotong-potong
dengan ukuran + 2 mm2
·
Potongan
kalus dimasukan kedalam tabung kultur berisi media MS II dengan menggunakan
jarum ose. 1 tabung kultur berisi 3 buah kalus
·
Tuliskan
varietas, tanggal penanaman kalus dan tanggal pemindahan kalus pada media MS II
pada tabung kultur tersebut, dan letakan tabung-tabung tersebut diatas rak
inkubasi
·
Amati
perkembangan kalus tersebut. Dalam waktu + 1 minggu disamping
pertumbuhan kalus berkembang, juga dapat dilihat bintik-bintik kecil berwarna
hijau yang pada perkembangan selanjutnya akan tumbuh menjadi akar bintik-bintik
merah pada kalus akan tumbuh menjadi akar
·
Setelah
+ 6 minggu planlet tersebut dapat di ploriferasi ke media MSR
H. PLORIFERASI DAN SPLIT PLORIFERASI
Tujuannya
: Memperbanyak pertumbuhan tunas secara cepat
·
Menyiapkan
tabung yang berisi media MSR dan tabung yang berisi tunas-tunas tebu yang siap
di ploriferasi
·
Menyiapkan
alat-alat seperti gunting, scalpel, pinset, jarum ose, telenan, lampu spiritus,
labu semprot dan bahan-bahan seperti kapas, alkohol, alumunium foil, dsb.
· Mensterilisasi
laminair air flow
·
Bakar
alumunium foil ditas lampu spiritus kemudian letakkan diatas telenan
·
Ambil
tabung kultur yang berisi tunas-tunas tebu, keluarkan tunas-tunas tersebut dari
tabung dan cuci bersih dengan air mengalir dan bilas dengan aquadest
·
Tunas-tunas
yang masih bergerombol tersebut akar dan daunnya dipotong, lalu dimasukan ke
tabung kultur yang berisi media MSR. 1 tabung berisi 3 gerombol
·
Setelah
4 - 6 minggu bisa di Split ploriferasi di media MSR baru dengan prosedur yang
sama
I. ROOTING
Tujuannya
: Menumbuhkan akar pada media MSR
·
Prosedur
kerjannya sama seperti ploriferasi dan split ploriferasi
·
Setelah
4 - 6 minggu siap untuk dipindahkan ke nampan yang berisi tanah steril
J. PRA
AKLIMATISASI DAN AKLIMATISASI
Tujuannya : Pemindahan planlet dari tabung kultur ke
media tanah steril dalam nampan dan ke polybag
· Menyiapkan
alat-alat yang dibutuhkan seperti gunting, nampan plastik, polybag, cangkul,
drum dll.
· Menyiapkan
campuran tanah steril dengan perbandingan tanah 1 : pupuk kandang 1 : pasir 1,
dengan cara : 1/3 bagian drum diisi campuran tanah, pupuk kandang dan pasir,
lalu diberi formalin 40 % sebanyak 600 cc. Lalu dilapisi campuran tanah lagi
1/3 bagian drum dan diberi formalin 40 % sebanyak 600 cc. Lalu sisanya dilapisi
campuran tanah lagi dan diberi formalin 400 cc. Permukaan atas dilapisi tanah
tipis, lalu drum ditutup dengan plastik dan diinokubasi selama 48 jam. setelah
48 jam tanah dikeluarkan dari drum dan dikeringanginkan, tiap hari dibalik,
sampai bau formalin hilang. Setelah itu tanah diayak dan dimasukan ke nampan
plastik
· Planlet
yang akan diaklimatisasi dikeluarkan dari tabung dicuci dan dibersihkan dari
sisa-sisa media
· Potong
ujung daunnya dan dipisahkan satu persatu dengan hati-hati, usahakan setiap planlet
mempunyai akar yang sempurna. Planlet yang terlalu kecil dipisahkan dalam
bentuk kelompok
· Setiap
planlet (tunggal atau kelompok) ditanam dalam nampan yang telah berisi tanah
steril
· Nampan-nampan
tersebut diletakan diudara terbuka namun masih dinaungi selama 5 hari,
selanjutnya tanaman tersebut dibawa ke lapang, pada umur 10 hari tanaman
dipupuk dengan ZA sebanyak + 0.05 gr/polybag (+ 1.5 gr/nampan)
setiap pagi & sore tanaman disiram
· Setelah
3-4 minggu tanaman dalam nampan displit tunggal ke polybag. Akar tanaman
dipotong, disisakan 2-3 cm, daun dipotong untuk mengurangi penguapan lalu
tanaman tersebut ditanam pada polybag yang berisi media tanah yang tidak steril
·
Tiap
pagi dan sore tanaman disiram, pada umur + 1 minggu tanaman dipupuk ZA
0.6 gr/polybag
·
Setelah
berumur 6 minggu tanaman dipindah ke kebun.
Selesai.....
Selesai.....
Comments